NEBuilder HiFi DNA Assembly ist die neue Generation der alternativen Klonierungsmethoden
Der NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix ermöglicht eine Restriktionsenzym-freie und einfache Assemblierung und Klonierung von einem oder mehreren DNA-Fragment(en) in einer isothermalen Reaktion in weniger als einer Stunde.
NEBuilder ist besser als bekannte Methoden (z.B. Gibson Assembly) und ist erhältlich als Cloning Kit inkl. kompetenter Zellen oder als flexibler Master Mix.
Die Methode ist kompatibel mit Vektoren/Fragmenten, die für Gibson Assembly konstruiert wurden.
- Schnelle und zuverlässige Klonierung von DNA-Fragmenten bis 20 kb
- Praktischer Master Mix für isothermale Single-Tube Reaktionen
- Fehlerfreie Assemblierung dank neuartiger proof-reading Polymerase
- Reaktionszeit unter 1 Stunde
- Inkl. optimaler NEB5-alpha „High Efficiency“ kompetenten E. coli Zellen (#E5520S)
- Keine Lizenzgebühren
- Besser als Gibson Assembly
NEBuilder Methode
(siehe auch Schemazeichnung)
- Sie benötigen zum Start komplementäre Bereiche (15-80 bp) der zu assemblierenden DNA. Diese werden z.B. durch PCR, Restriktionsverdau etc. erzeugt. Beim optimalen PCR Primer-Design hilft Ihnen Ihnen unser NEBuilder Assembly Tool.
- Die Fragmente werden dann mit dem NEBuilder Master Mix behandelt: Die Exonuklease erzeugt einzelsträngige 3‘-Überhänge. Die komplementären Überhänge der Fragmente hybridisieren.
- Eine neuartige proof-reading Polymerase füllt die einzelsträngigen Lücken zwischen den Fragmenten fehlerfrei auf und entfernt eventuell vorhandene, nicht-komplementäre Bereiche (z. B. 3′ oder 5′ Enden ehemaliger Restriktionsschnittstellen). Die verbleibenden Nicks in der DNA werden mit der Ligase geschlossen. Die fertigen DNA-Konstrukte (bis 20kb!) sind sofort bereit für die Transformation!
Schemazeichung NEBuilder Methode
Klicken Sie zum vergrößern
Anwendungsmöglichkeiten des neuformulierten NEBuilder DNA Assembly Kits
Klicken Sie zum vergrößern
Hier finden Sie Performance-Daten von NEBuilder der neuesten Formulierung im Vergleich zu anderen Konkurrenzprodukten:
NEBuilder Assembly Tool
Berechnen Sie die optimalen Primer-Sequenzen für Ihr NEBuilder oder Gibson Assembly Experiment.
NEBioCalculator
Schnell und einfach verschiedene Parameter von DNA und RNA bestimmen und umrechnen.
FAQ
Was ist der Vorteil von NEBuilder HiFi DNA Assembly gegenüber klassischer Klonierung?
NEBuilder HiFi DNA Assembly ermöglicht die Klonierung eines oder mehrerer DNA Fragmente an praktisch jeder Position des Vektors. Die Methode benötigt keine Restriktionsschnittstellen oder andere konstanten Sequenzen. NEBuilder HiFi DNA Assembly ist schneller als die herkömmliche Klonierung und es können mehr Fragmente in einer Reaktion verbunden werden.
Wie viele Fragmente können in einer Reaktion verbunden werden?
Mit dem NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix wurden bereits bis zu elf 0,4 kb große Inserts in ein Vektorfragment assembliert. Die maximale Anzahl von DNA Fragmenten in einer Reaktion hängt allerdings von der Länge und der Sequenz der Fragmente ab. Daher empfehlen wir zunächst nicht mehr als fünf Inserts gleichzeitig in einen Vektor zu klonieren um korrekte Klone zu erhalten.
Was ist das größte Plasmid, dass bis jetzt mit NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix assembliert wurde?
Der NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix wurde zur erfolgreichen Klonierung eines 12 kb Inserts in einen 7,4 kb großen Vektor verwendet, das Produkt war also über 19 kb groß. Für die Transformation von assemblierten Plasmiden größer 15 kb empfehlen wir NEB 10-beta Competent E. coli (High Efficiency, NEB #C3019), die im neuen NEBuilder HiFi DNA Assembly Bundle for Large Fragments (NEB #E2623) enthalten sind.
Können einzelsträngige DNA Oligos mit doppelsträngigen DNA Fragmenten assembliert werden?
Ja. Allerdings muss hier die optimale Konzentration jedes Oligos bestimmt werden, als Ausgangswert empfehlen wir 45 nM für jedes Oligo. Bis zu 12 Oligos à 60 Basen mit je 30 Basen Überlappender Sequenz können so assembliert werden. Lesen Sie dazu auch unsere Application Note „Bridging dsDNA with a ssDNA Oligo“.
Kann die assemblierte DNA durch PCR vervielfältigt werden?
Ja, die Fragmente werden kovalent verbunden und können als Template für eine PCR verwendet werden. Wenn die assemblierte DNA zirkulär ist, kann Sie auch für RCA (Rolling Circle Amplification) eingesetzt werden.
Wie kann ich Hintergrund-Kolonien mit Leervektor minimieren?
Den geringsten Hintergrund erhalten Sie, wenn Sie das Vektor-Fragment durch PCR herstellen, anstatt durch Restriktionsverdau. Zusätzlich können Sie nach der PCR einen DpnI Verdau anschließen, um den Übertrag des Ausgangsplasmids in die Assembly-Reaktion zu minimieren. Wir empfehlen außerdem, das Vektorfragment aus einem präparativen Agarosegel nach Elektrophorese zu extrahieren. Dafür eignet sich das neue Monarch DNA Gel Extraction Kit #T1020.
Vergleich NEBuilder und Gibson Assembly
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix ist effizienter und genauer als Gibson Assembly, unabhängig von der Anzahl der zu assemblierenden Fragmente.
Die Reaktionen wurden gemäß den jeweiligen Empfehlungen für 2- bzw. 6-Fragment Assemblierungen angesetzt.
Die Effizienz und Genauigkeit der Assemblierung kann bei niedrigeren DNA Input Mengen bei Verwendung des NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix durch längere komplementäre Bereiche erhöht werden.
Die Reaktionen wurden gemäß den jeweiligen Empfehlungen für eine 4-Fragment Assemblierung angesetzt.
Der NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix zeigt eine deutlich
geringere Fehlerrate als der Gibson Assembly Master Mix.
Die Fehlerrate von NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix und Gibson Assembly Master Mix wurde anhand verschiedener Assembly-Produkte verglichen. Die Experimente wurden gemäß den jeweiligen Protokoll-Empfehlungen durchgeführt. Die Experimente F und H wurden mit Fragmenten mit nicht kompatiblen 3′-Überhängen (durch Restriktionsverdau erhalten) durchgeführt.
Videos
Introduction to NEBuilder HiFi DNA Assembly
Primer Design and Fragment Assembly Using NEBuilder HiFi DNA Assembly or Gibson Assembly
NEBuilder HiFi DNA Assembly: Bridging dsDNA with a ssDNA Oligo
Lesenswerte Application Notes
Produkttabelle
| PRODUKT | Art. # | GRÖSSE | INFO | |
|---|---|---|---|---|
| NEBuilder® HiFi DNA Assembly Cloning Kit | E5520S | 10 rxns |  |
 |
| NEBuilder® HiFi DNA Assembly Master Mix | E2621S | 10 rxns | |
|
| E2621L | 50 rxns | |
|
|
| E2621X | 250 rxns | |
|
|
| NEBuilder® HiFi DNA Assembly Bundle for Large Fragments | E2623S | 20 rxns | |
|
Stand: 01.01.2024
Weiterführende Informationen finden Sie unter Technische Ressourcen oder auf neb.com. Informationen zu Namensrechten finden Sie hier.
