Restriktionsenzyme

Einsatzgebiete von Restriktionsenzymen

Restriktionsenzyme werden in der Molekularbiologie traditionell für die Klonierung eingesetzt. Hier wird der Verdau der DNA durch die Enzyme genutzt, um kompatible DNA Enden zu erzeugen. Diese Enden werden anschließend mittels einer DNA Ligase verbunden.

Die zu klonierende DNA kann sehr unterschiedlich sein, von genomischer DNA, über in cDNA umgeschriebene mRNA bis hin zu einem zuvor klonierten Gen, das von einem Vektor zum anderen bewegt werden muss (Subklonierung). Restriktionsenzyme können auch verwendet werden, um kompatible Enden von PCR-Produkten zu erzeugen. In allen Fällen werden ein oder mehrere Restriktionsenzyme verwendet, um die DNA zu verdauen, was eine ungerichtete oder gerichtete Insertion in das kompatible Plasmid ermöglicht.

Neben diesem klassischen Einsatzgebiet werden Restriktionsenzyme in der modernen Molekularbiologie auch vermehrt in anderen Methoden eingesetzt.

In den letzten Jahren haben alternative Klonierungsmethoden, wie Gibson Assembly, NEBuilder HiFi DNA Assembly oder Golden Gate Assembly, an Bedeutung gewonnen.

So werden für Golden Gate Assembly Typ IIS Restriktionsenzyme benötigt. Diese schneiden in einem definierten Abstand von Ihrer Erkennungssequenz. Mit dieser Methode ist es möglich, DNA Abschnitte zu verbinden, ohne dass die final entstehende Basenabfolge die Erkennungssequenz der verwendeten Enzyme enthält.

In der Epigenetischen Forschung werden Restriktionsenzyme verwendet, welche abhängig vom Methylierungsstatus DNA schneiden oder nicht.

Daneben gibt es noch weitere speziellere Methoden, in denen bestimmte Typen von Restriktionsenzymen eingesetzt werden, wie z.B. die Droplet Digital PCR (ddPCR).

Typen von Restriktionsenzymen

Typ I Enzyme

Ein Typ I Restriktionsenzym ist ein komplexes Enzym, welches aus mehreren Untereinheiten besteht. Bei Typ I Enyzmen handelt es sich um kombinierte Restriktions- und Modifikationsenzyme, die DNA nach dem Zufallsprinzip weit weg von ihren Erkennungssequenzen schneiden. Enzyme vom Typ I sind von erheblichem biochemischem Interesse, haben aber bislang wenig praktischen Wert.

Typ II Enzyme

Restriktionsenzyme vom Typ II schneiden DNA an definierten Positionen in der Nähe oder innerhalb ihrer Erkennungssequenzen. Sie produzieren definierte Restriktionsfragmente. Typ II Enzyme sind die einzige Klasse von Restriktionsendonukleasen, die im Labor für die routinemäßige DNA-Analyse und die Genklonierung verwendet wird.

Die häufigsten Enzyme vom Typ II sind solche, die DNA innerhalb ihrer Erkennungssequenz spalten. Dabei erkennen die meisten von Ihnen symmetrische DNA-Sequenzen, da sie als Homodimere an die DNA binden. Nur wenige erkennen asymmetrische DNA-Sequenzen, diese Enzyme binden als Heterodimere.

Die nächsthäufigsten Typ II Restriktionsenzyme, die normalerweise als „Typ IIS“ bezeichnet werden, sind solche, die außerhalb ihrer Erkennungssequenz DNA schneiden. Diese Enzyme bestehen aus zwei verschiedenen Domänen, eine für die DNA-Bindung, die andere für die DNA-Spaltung. Es wird angenommen, dass sie zum größten Teil an DNA als Monomere binden, aber DNA kooperativ spalten. Dazu dimerisieren sie mit den Spaltdomänen benachbarter Enzymmoleküle. Aus diesem Grund haben einige Typ-IIS-Enzyme eine erhöhte Aktivität an DNA-Molekülen, die mehrere Erkennungsstellen enthalten.

Typ-IIG-Restriktionsenzyme, die dritte große Art von Typ-II-Enzymen, sind große, kombinierte Restriktions- und Modifikationsenzyme. Diese Enzyme schneiden außerhalb ihrer Erkennungssequenzen. Einige erkennen kontinuierliche Sequenzen erkennen und schneiden einmal außerhalb dieser Sequenz. Andere erkennen diskontinuierliche Sequenzen und schneiden auf beiden Seiten der Erkennungssequenz. Dabei entsteht ein kleines DNA Fragment, das die Erkennungssequenz enthält.

Typ III Enzyme

Typ III Enzyme sind ebenfalls Kombinationen von Restriktions- und Modifikationsenzymen. Sie schneiden außerhalb ihrer Erkennungssequenzen und benötigen zwei solcher Sequenzen in entgegengesetzter Ausrichtung innerhalb desselben DNA-Moleküls.

Typ IV Enzyme

Enzyme vom Typ IV erkennen modifizierte, typischerweise methylierte DNA. Die Hauptvertreter werden durch die McrBC- und Mrr-Systeme von E. coli gestellt.