Tipps für erfolgreiche Transformation mit kompetenten Zellen von NEB
Schauen Sie das Video und verfolgen Sie die einzelnen Arbeitsschritte, die zu ausgezeichneten Ergebnissen bei der Transformation von NEBs kompetenten Zellen führen.
Tech-Tipp: So erhalten Sie optimale Effizienzen bei der Transformation mit NEBs kompetenten E. coli
Auftauen
Tauen Sie Ihre kompetenten NEB-Zellen stets auf Eiswasser auf. Eine Erwärmung auf >0°C verschlechtert die Transformationseffizienz erheblich. Sobald Ihre Zellen aufgetaut sind, geben Sie Ihre Plasmid-DNA dazu.
DNA Qualität
Ihre zu transformierende DNA sollte möglichst „sauber“ und in TE-Puffer oder H2O gelöst sein. Verwenden Sie hierbei über Säulchen gereinigte oder Phenol / Chloroform extrahierte DNA. Wenn Sie nicht-aufgereinigte Ligationsansätze transformieren möchten, so können Sie bis zu 10 μl einsetzen: Ihre Transformationseffizienz ist dabei allerdings um ca. 50% reduziert.
DNA Menge
Die optimale DNA-Menge ist niedriger als häufig angenommen. Wenn Sie z.B. saubere, „supercoiled“ pUC19-DNA verwenden, erreichen Sie mit nur 100 pg – 1 ng die besten Effizienzen! Allerdings steigt die absolute Anzahl der erhaltenen Kolonien pro Transformationsreaktion bei DNA-Mengen bis zu 100 ng weiter an.
DNA Effects on Transformation Efficiency and Colony Output: The optimal amount of DNA to use in a transformation reaction is lower than commonly recognized. Using clean, supercoiled pUC19, the efficiency is highest in the 100 pg-1 ng range. However, the total colonies which can be obtained from a single reaction increase up to about 100 ng.
Inkubation von DNA und Zellen
Für beste Ergebnisse inkubieren Sie Ihre Zellen mit der Ziel-DNA auf Eis für 30 min. Für jede 10 min, die Sie diesen Schritt verkürzen, halbieren Sie die Transformationseffizienz.
Effect of DNA incubation time on NEB 5-alpha competent E.coli transformation efficiency: 50 μl of competent cells were transformed with 100 pg of pUC19 control DNA following the provided High Efficiency Transformation Protocol except DNA incubation time varied from 0 to 40 minutes.
Hitzeschock
Temperatur und Länge des Hitzeschocks sind abhängig vom Volumen des Transformationsansatzes und des verwendeten Gefäßes. Als guten Richtwert empfehlen wir Ihnen 30 sec. bei 42 °C.
Effect of heat shock time on NEB 5-alpha competent E.coli transformation efficiency: 50 μl of competent cells were transformed with 100 pg of pUC19 control DNA following the provided High Efficiency Transformation Protocol except heat shock time varied from 0 to 80 seconds.
Zellregeneration
Zur phänotypischen Expression des Selektionsmarkers Ihres; Plasmides und zur Regeneration der Zellen sollten Sie Ihre frisch transformierten E. colis für 1 Stunde bei 37 °C inkubieren. Das mitgelieferte SOC-Medium gibt Ihnen hierbei bis zu 4-fach bessere Transformationseffizienzen als einfaches LB-Medium. Eine gute Belüftung durch Schütteln oder Rollen verdoppelt hierbei Ihre Transformationseffizienz.
Effect of outgrowth medium on transformation efficiency: 50 μl of NEB 5-alpha competent E.coli was transformed with 100 pg of pUC19 control DNA following the provided High Efficiency Transformation Protocol with the exception of varying the outgrowth medium. NEB SOC outgrowth medium delivers the highest efficiency.
Plattieren der Zellen
Das Vorwärmen, Kühlen, Trocknen oder Befeuchten der Selektionsagarplatten hat keinen Einfluss auf Ihre Transformationseffizienz! Allerdings können Sie Ihre Zellen auf vorgewärmten und getrockneten Platten besser ausplattieren, und die Bakterienkolonien wachsen schneller.
Benefit from the high transformation efficiencies of NEB 5-alpha: The transformation efficiencies of NEB 5-alpha and DH5α were compared using each manufacturer’s recommended protocols. Values shown are the average of triplicate experiments.
Take advantage of the low cost per transformation with NEB 5-alpha. Calculations were based on list price and recommended transformation volumes.
Weiterführende Informationen finden Sie unter Technische Ressourcen oder auf neb.com. Informationen zu Namensrechten finden Sie hier.
