Reverse Transkription / cDNA Synthese

ProtoScript^® II Reverse Transcriptase

NEBs ProtoScript II Reverse Transcriptase ist eine rekombinante, mutierte Version der M-MuLV RTase mit reduzierter RNase H-Aktivität und erhöhter Temperaturstabilität. Die ProtoScript® II Reverse Transcriptase ermöglicht besonders lange cDNAs bis über 10 kb (full length transcripts). Durch die Erweiterung des Temperaturspektrums (bis auf 48°C ! ) können auch schwierige RNA- Sekundärstrukturen (z.B. in 3’ UTRs) zuverlässig und in hohen Ausbeuten in cDNA umgeschrieben werden.

Die ProtoScript® II Reverse Transcriptase von NEB zeichnet sich außerdem durch eine exzellente Sensitivität aus. So ist z.B. eine Input-Menge von weniger als 1 pg Total RNA (oder 5 RNA Moleküle einer spezifischen mRNA) für eine erfolgreiche RT-PCR notwendig.

Fazit: ProtoScript® II Reverse Transcriptase von NEB ist ideal für alle Anwendungen, in denen zuverlässig und in hohen Ausbeuten full-length cDNA benötigt werden (z.B. Klonierungen, RT-PCR, qPCR, etc.).

Performance

Die neue ProtoScript® II Reverse Transcriptase von NEB: Vergleichbare oder bessere Performance im Vergleich zu Mitbewerbern

1 µg Total RNA (aus Jurkat Zellen) wurde für eine Erststrang-cDNA Synthese eingesetzt (20 µl Gesamtvolumen). Alle Reaktionskomponenten (mit Ausnahme der RTase) wurden gemischt und dem Protokoll entsprechend für 3 min vorinkubiert. Es wurden 200 units von NEB’s ProtoScript® II Reverse Transcriptase (A) oder SuperScript® II (B) hinzugefügt und für 50 min wie in Abbildung angegeben bei unterschiedlichen Temperaturen inkubiert und anschließend für 5 min bei 80°C Hitze-inaktiviert. 1 µl der gewonnenen cDNA diente als Template für eine 25 µl Kontroll-PCR (35–40 Zyklen) mit LongAmp® Hot Start Taq 2X Master Mix. Marker M ist die Quick-Load® 2-Log DNA Ladder.

Schwierige Templates

Hochqualitative cDNA sogar bei geringsten Mengen an RNA Ausgangsmaterial

Abnehmende Mengen an Jurkat Total RNA (1 μg – 1 pg) wurden für eine Erststrang-cDNA Synthese mit 200 units ProtoScript® II Reverse Transcriptase eingesetzt (20 µl Gesamtvolumen). Die Synthese wurde für 50 min bei 42°C durchgeführt und anschließend für 5 min bei 80°C Hitze-inaktiviert. 1 µl der gewonnenen cDNA diente als Template für eine 25 µl Kontroll-PCR (40 Zyklen) mit LongAmp® Hot Start Taq 2X Master Mix. Die Bande bei 0,6 kb ist eine spezifische Amplifikation der GAPDH cDNA. Marker L ist die Quick-Load® 2-Log DNA Ladder.

ProtoScript^® II Reverse Transcriptase ist extrem sensitiv

Abnehmende Mengen an Luciferase mRNA (109 bis 102) Moleküle wurden in Gegenwart von 1 ng Jurkat Total RNA in cDNA umgeschrieben (50 units ProtoScript® II Reverse Transcriptase ) 20 µl Gesamtvolumen. 1 µl des cDNA Produktes wurde mit dem qPCR Kit SsoAdvanced™ SYBR® Green Supermix analysiert. Der Nachweis von lediglich 5 Molekülen Luciferase mRNA belegt die exzellente Sensitivität der cDNA Synthese mit der NEB ProtoScript® II Reverse Transcriptase.

Produkttabelle

PRODUKT	Art. #	GRÖSSE	INFO
ProtoScript® II Reverse Transcriptase	M0368S	4.000 units
	M0368L	10.000 units
	M0368X	40.000 units
ProtoScript® II First Strand cDNA Synthesis Kit	E6560S	30 reactions
	E6560L	150 reactions
AMV Reverse Transcriptase	M0277S	200 units
	M0277L	1.000 units
M-MuLV Reverse Transcriptase	M0253L	50.000 units
	M0253S	10.000 units
Murine RNase Inhibitor	M0314L	15.000 units
	M0314S	3.000 units
Passend dazu:
Deoxynucleotide Solutions, Mix	N0447S	8 µmol of each
	N0447L	40 µmol of each

Stand: 01.01.2024