K. lactis Protein Expression Kit: Ideal für die Expression eukaryotischer Proteine

Bei heterologer Proteinexpression mit anschliessender Aufreinigung denkt man zunächst an das „klassische Arbeitspferd” des Molekularbiologen, E. coli.

Will man jedoch eukaryotische Proteine in Bakterien exprimieren, so ergeben sich häufig substantielle Probleme:
Viele eukaryotische Proteine werden nämlich post-translational durch Glykosylierung im ER bzw. Golgi-Apparat modifiziert. Weil den Prokaryoten entsprechende Organellen fehlen, können diese Proteine in E. coli nicht nativ exprimiert werden. Viele dieser nicht-modifizierten Proteine falten sich bei E. coli Expression nicht korrekt oder bilden „inclusion bodies”.

Das größte Problem jedoch ist die Tatsache, dass nicht-glykosylierte eukaryotische Proteine häufig inaktiv oder nicht-funktionell sind. Oder aber das Zielprotein ist für den bakteriellen Wirtsstamm toxisch und Sie erhalten keine hinreichenden Ausbeuten.

Das auf dem Hefestamm Kluyveromyces lactis basierende Expressionssystem schafft hier Abhilfe:
Nach Klonierung Ihres DNA-Fragmentes in den pKLAC1 Vektor und nachfolgender Expression erhält Ihr Protein die notwendigen Signalsequenzen und wird daher von der Hefe durch ER/ Golgi prozessiert und anschließend sekretiert.

Ihr Zielprotein befindet sich nun in glykosylierter Form im Überstand des Zellkulturmediums und kann von dort aus der laufenden Kultur problemlos ohne Zelllyse geerntet und bei Bedarf weiter aufgereinigt werden.

In wenigen Schritten zum stabilen Expressionsklon

Sie klonieren wie gewohnt in E. coli Ihre DNA-Sequenz in den integrativen pKLAC1 Vektor hinter den P_LAC4-PBI Promotor. Dadurch erhält Ihr Zielprotein α-Matingtype Signalsequenzen, die für die Sekretion notwendig sind.

Der resultierende rekombinante pKLAC-1 Vektor wird in die beiliegenden kompetenten K. lactis Zellen transformiert. Der Vektor kodiert neben Ihrem Zielprotein auch für eine Acetamidase. Durch Anzucht des Wirtsstammes in einem C-haltigen Minimal-Medium ohne N-Quelle können Sie durch eine einfache Acetamid-Zugabe (als einzig verfügbare N-Quelle) auf positive Transformanten (d.h. inkl. Acetamidase und Ihrem Zielprotein) ohne Verwendung von teuren Antibiotika (z.B. Zeocin, Geneticin) selektionieren.

Der Vektor integriert stabil ins Genom des Wirtes und kann so konstitutiv (d.h. ohne Induktion) über viele Zellteilungen die Expression des Zielproteins dauerhaft zu extrem grossen Mengen antreiben.

Schema K. lactis Expression und Sekretion des Zielproteins: Der rekombinante Expressionsvektor integriert in das Genom des Wirtes und führt so zur Expression einer Fusion aus Ihrem Zielprotein und der Signal-Peptid α-MF-Domain (vom Vektor). Die Signalsequenzen bewirken, dass das Fusionsprotein durch das Endoplasmatische Retikulum (ER) und den Golgi Apparat geschleust und sekretiert wird. Dabei werden die Signalsequenzen von der Signal Peptidase und der Kex Protease von Ihrem Zielprotein abgetrennt und das Zielprotein glykosyliert.

Verfügbare K. lactis Produkte:

PRODUKT	Art.Nr.:	GRÖSSE	INFO
K. lactis Protein Expression Kit	E1000S	1 Kit
K. lactis GG799 Competent Cells	C1001S	5 rxn
Yeast Carbon Base Medium Pack ( K. lactis)	B9017S	12,0 g

Stand: 03.01.2024